细胞与分子生物学论文：细胞死亡方式及其检测方法

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标题：细胞与分子生物学论文：细胞死亡方式及其检测方法

细胞与分子生物学论文：细胞死亡方式及其检测方法

摘要：细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。细胞死亡包括坏死和凋亡两大类型。传统的细胞死亡方式分类包括细胞坏死和细胞凋亡2种，后者又称为程序性细胞死亡。死亡的原因很多，一切损伤因子只要作用达到一定强度或持续一定时间，从而使受损组织的代谢完全停止，就会引起细胞、组织的死亡。近期又发现了很多细胞死亡的途径，为了能够对细胞死亡有更透彻的了解，我们可以从其检测方法入手，反向地学习死亡途径和方法，本文总结了最常用的检测方法。
关键词：细胞死亡，凋亡，坏死，检测方法，DNA片段，
Abstract：The traditional way of cell death classification includes cell necrosis and apoptosis, the latter also is known as programmed cell death, recently we have discovered a lot of cell death pathways, in order to be have a more thorough understanding, we can start with detection method so that have a good understanding of means of death. this article summarizes the most commonly used detection methods and will get a great help for our learning.
Key words: cell death, Apoptosis, Necrosis, Detection methods, DNA fragments

长期以来, 细胞死亡方式分为　……（快文网http://www.fanwy.cn省略1405字，正式会员可完整阅读）……
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至核模周边形成新月形凝集，进而细胞核裂解为碎块，进而细胞膜内陷自行分割成几个由细胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小体( Apoptotic body)；DNA 被特异性的核酸内切酶分解成18 0 ~ 220bp的片断，琼脂糖电泳出现特征性DNA梯状区带，在细胞凋亡早期需要大量的ATP。
1.3凋亡和坏死的区别
为了更加彻底明白两种死亡方式的不同，可以从两种的不同特征做个比较。如表一

表一：细胞凋亡和细胞坏死的区别
特征细胞凋亡细胞坏死
诱发因素特定的或生理性各种病理性
细胞数量单个细胞丢失成群细胞死亡
质膜完整保持肿胀溶解破裂
细胞核固缩破裂为片段溶解破裂
染色质凝集呈半月状模糊疏松
线粒体肿胀通透性增加，细胞C释放肿胀破裂
细胞器完整损伤
内含物释放无有
炎症反应无有
核DNA 降解为完整倍数大小的片段随机不规则断裂
凝胶电泳梯状条带形分散形态
2. 细胞死亡检测方式
细胞死亡的方式可根据形态学、细胞膜通透性及染色体变化情况，并可结合各种染色或标记方法来确定。最常用的观察方法是用光镜、电镜或共聚焦荧光显微镜观察细胞、细胞核形态、细胞膜及细胞超微结构的改变，并按目前大多数学者接受的形态学标准加以鉴别。
2.1线粒体跨膜电位检测法
线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电化学梯度，在细胞凋亡过程中常因膜孔道大小的改变及转膜电位的降低来调节细胞凋亡。在凋亡早期，当线粒体形态学方面尚无明显变化时，其膜电位已经发生耗散。因此，其膜电位的耗散被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，而且一旦线粒体膜电位耗散，凋亡就不可逆转。但使用该方法时要始终保持平衡染液pH值的一致性。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如JC-1等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。但是要注意的是，除了在凋亡中出现线粒体去极化外，在胀亡中也可发生此现象。[8]
2.2 DNA片段检测
细胞发生凋亡或坏死时，DNA发生断裂，胞质内出现DNA片段。探测DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳、酶联免疫吸附法、TUNEL法及其它检测方法如ISEL( insitu end labeling)、ISOL( Insituo ligo Ligation)。
2.2.1TUNEL法
TUNEL方法是通过检测DNA 双链断裂暴露出的粘性3c-OH 末端来确定凋亡的经典方法。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，DNA的3c-末端与荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的脱氧核糖核苷酸结合，从而进行凋亡细胞检测。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离出来的细胞，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。用光学显微镜或共聚焦显微镜观察TUNEL检测结果，阳性着色的为凋亡细胞[11]。TUNEL法标记的是凋亡晚期阶段的细胞，在此阶段,细胞形态已经明显紊乱。虽然TUNEL 方法能识别发生凋亡的细胞，但是有时凋亡和坏死重叠，因此一些凋亡性细胞未染色。这使得在一些情况下会低估凋亡信息。而且，甲醛固定能妨碍TUNEL染色，被标记的细胞和周围正常细胞的对照性较差。在组织切片上难以确定准确结果。TUNEL染色对凋亡来说不是特异的，在胀亡中也可以见到[12]。
2.2.2琼脂糖凝胶电泳和酶联免疫吸附法
凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180~200 bp DNA片段，而胀亡或坏死细胞DNA 断裂点为无特征的弥漫性随机片段，利用这些特征使用琼脂糖凝胶电泳可以确定细胞的死亡方式。凋亡细胞经电泳后出现阶梯状(DNA Ladder) 条带；而胀亡或坏死细胞经电泳后呈随机性电泳条带[9]。观察DNA最常用的方法是利用荧光染料EB进行染色。凝胶应该在无EB情况下电泳, 电泳结束后用EB染色。但是要注意的是，在坏死中发生的蛋白水解途径也能导致将DNA分裂为核小体间片段的酶激活，因此也可能出现DNA 阶梯状条带，这与凋亡过程中见到的情况不能区别[10]。
凋亡细胞的DNA 断裂使细胞质内出现核小体，核小体由组蛋白及DNA片段组成，可用酶联免疫吸附法检测。
2.3组化染料
根据染料与细胞组分结合的不同分为细胞核染料、细胞膜染料和细胞质染料。死亡的细胞和活的细胞与染料的亲和性不同，在电镜下观察可以分辨出细胞的存活情况。
2.3.1细胞核染料
常用的细胞核染料有Hoechst、PI、DAPI、AO(acrid ine orange)和EB等方法。
2.3.1.1 Hoechst是一种不需要透化作用就可以穿透细胞膜并将DNA 染色的的蓝色荧光染料[16]，是与DNA 特异结合的非细胞毒性活性染料，优先与双螺旋小沟外面的三个腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基对结合[17]，既可染有活力的细胞又可染发生凋亡的细胞，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜(在紫外光照明下)观察或流式细胞仪检测。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染，凋亡细胞的凝缩染色质着色比正常细胞的染色质更亮。
2.3.1.2 PI是一种核酸荧光染料，用作死亡或正在死亡细胞的一种标志物，因为此染料不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损细胞膜进入细胞[18]，所以在凋亡晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。PI染阳性、细胞核不凝聚或断裂的细胞认为是坏死性的[19]。
2.3.1.3 DAPI( 4c,6-d iam id ino-2-pheny lindo le) DAPI也是一种标记细胞核的蓝色荧光染料，能够与DNA中大部分A、T碱基相互结合，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。DAPI染色常用于细胞凋亡检测。染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。在荧光显微镜下观察时，利用紫外光激发，显示染色体浓缩、核分成小裂片或断裂。
2.3.1.4 AO为一种膜通透性活体染料，可区别正常和凋亡细胞核，在活细胞中，AO 可作为一种PH 指示剂，因为它被酸性层包围时会发出鲜亮的黄或橘红色光。正常和凋亡性细胞核染色不同，正常PH 时, AO将双链核酸染为绿色，在凋亡过程中因为细胞核酸化、PH 值降低而将凋亡细胞核染为黄或橘红色。因此，AO已被用作识别凋亡细胞的染色方法，这种简单的方法可灵活地附加到其它方法以识别和研究凋亡性细胞。如依次使用AO和EB染色，使用共聚焦显微镜观察。EB不能穿透活细胞的质膜，而只穿过受损的细胞膜进 ……（未完，全文共10114字，当前只显示3652字，请阅读下面提示信息。收藏细胞与分子生物学论文：细胞死亡方式及其检测方法）

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